Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция преципитации (РП)

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

Биохимические свойства в основном типичны для рода Salmonella. Отличительными особенностями являются: отсутствие газообразования при ферментации S. Typhi, неспособность S. Paratyphi A продуцировать сероводород и декарбоксилировать лизин.

Эпидемиология. Брюшной тиф и паратифы являются антропонозами, т.е. вызывают заболевание только у человека. Источником инфекции являются больной или бактерионоситель, которые выделяют возбудитель во внешнюю среду с испражнениями, мочой, слюной. Возбудители этих инфекций, как и другие сальмонеллы, устойчивы во внешней среде, сохраняются в почве, воде. S. Typhi может переходить в некультивируемую форму. Благоприятной для их размножения средой являются пищевые продукты (молоко, сметана, творог, мясной фарш, студень). Передача возбудителя осуществляется водным путем, играющим в настоящее время существенную роль, а также алиментарным и контактно-бытовым путями. Заражающая доза равна приблизительно 1000 клеткам. Естественная восприимчивость людей к этим инфекциям высокая.

Патогенез и клиническая картина. Попав в тонкую кишку, возбудители тифа и паратифов инвазируют слизистую оболочку при

помощи эффекторных белков ТТСС-1, формируя первичный очаг инфекции в пейеровых бляшках. Следует отметить, что в под- слизистой оболочке осмотическое давление по сравнению с просветом кишечника ниже. Это способствует интенсивному синтезу Vi-антигена, который увеличивает антифагоцитарную активность возбудителя и подавляет выброс провоспалительных тканевых медиаторов клетками подслизистой оболочки. Следствием этого яв- ляются отсутствие развития воспалительной диареи на начальных этапах инфекции и интенсивное размножение микробов в макрофагах, приводящее к воспалению пейеровых бляшек и развитию лимфаденита, следствием чего являются нарушение барьерной функции мезентериальных лимфатических узлов и проникновение сальмонелл в кровь, в результате чего развивается бактериемия. Это совпадает с концом инкубационного периода, который длится 10-14 сут. Во время бактериемии, которая сопровождает весь лихорадочный период, возбудители тифа и паратифов с током крови разносятся по организму, оседая в ретикулоэндотели- альных элементах паренхиматозных органов: печени, селезенки, легких, а также в костном мозгу, где они размножаются в макрофагах. Из купферовских клеток печени сальмонеллы по желчным протокам, в которые они диффундируют, попадают в желчный пузырь, где они также размножаются. Накапливаясь в желчном пузыре, сальмонеллы вызывают его воспаление и с током желчи реинфицируют тонкую кишку. Повторное внедрение сальмонелл в пейеровы бляшки приводит к развитию в них гиперергического воспаления по типу феномена Артюса, их некрозу и изъязвлению, что может привести к кишечному кровотечению и прободению кишечной стенки. Способность возбудителей брюшного тифа и паратифов сохраняться и размножаться в фагоцитирующих клетках при функциональной недостаточности последних приводит к формированию бактерионосительства. Сальмонеллы также могут длительное время сохраняться в желчном пузыре, выделяясь с фекалиями в течение длительного времени, и контаминировать окружающую среду. К концу 2-й нед заболевания возбудитель начинает выделяться из организма с мочой, потом, материнским молоком. Диарея начинается в конце 2-й или начале 3-й нед заболевания, с этого время возбудители высеваются из фекалий.

Бактерии могут все и еще чуть-чуть. Они создали наш мир – пригодный для дыхания воздух, плодородную почву, полезные ископаемые. Даже возникновение жизни на Земле – результат такого свойства бактерий, как изменчивость, способность тщательно отбирать и передавать по наследству генетическую информацию, направленную на сохранение и развитие вида.

Свойство – это отличительная черта, характерный признак предмета или объекта. Микробиология изучает свойства микроорганизмов – их строение, закономерности развития, роль в сохранении природного баланса и хозяйственной деятельности человека.

При изучении одноклеточных первый этап идентификации опирается на общие свойства бактерий, присущие всем прокариотам (безъядерным клеткам):

• микроскопические размеры (не видны невооруженным взглядом);
• огромная скорость обмена веществ и, как следствие, роста и размножения;
• быстрая адаптация к изменившимся условиям существования;
• способность меняться в короткие сроки с передачей наследственности;

Еще одна черта, общая для всех одноклеточных, – широкое распространение. Микроорганизмы существуют везде – в воде, воздухе, земле, организме человека и животных. Граничные условия их обитания простираются от температур в сотни градусов и давления воды на глубине в несколько километров до разреженного воздуха и отрицательных температур стратосферы. Правда, любопытные исследователи нашли место на земле, где не так-то просто найти бактерии, – отдельные участки пустыни Атакама (Южная Америка). Эта земля не видела дождя десятки, а возможно, и сотни лет. Даже бактерии сдались – вода необходима любой форме белковой жизни.

Идентификация бактерий по видам

Ученые разделяют бактерии по видам, вернее, пытаются это сделать. Предположительно (ну не известно науке точно!) существуют миллионы видов бактериальных клеток. Но «узнать в лицо» наука может только несколько десятков тысяч, характеристики которых хорошо изучены. Например, бифидобактерии и лактобактерии необходимы для пищеварения, свойства молочнокислых бактерий и дрожжевых грибков используются в промышленности, патогенные микроорганизмы несут болезни или вызывают пищевые отравления, образуя опасные токсины и т. д.

Для видовой идентификации бактерий нужно знать следующие их свойства:

• морфологические (форма, строение клетки);
• культуральные (способ питания, условия размножения, т. е факторы роста бактериальной культуры);
• тинкториальные (реакция на красители, помогающая определить степень опасности для здоровья);
• биохимические (расщепление питательных веществ, выделение продуктов жизнедеятельности, синтез ферментов, белков, витаминов);
• антигенные (от англ. antibody-generator – «производитель антител»), вызывающие иммунную реакцию организма.

Морфологические свойства определяют с помощью микроскопии (рассматривая в обычный или электронный микроскоп). Культуральные (биологические) свойства проявляются во время роста культур на питательных средах. Идентификация по биохимическим свойствам нужна для определения отношения клетки к кислороду (способ дыхания), ее ферментативных и редуцирующих (восстановительных) свойств (редукция – химический процесс отнятия кислорода или замена его на водород). Кроме того, биохимические исследования изучают образование отходов жизнедеятельности бактерий (токсинов) и их влияние на окружающую среду.

Анализ всех этих свойств в совокупности помогает определить вид бактериальной клетки. Такая идентификация дает возможность отличать «хорошие» бактерии, приносящие пользу, от вредных болезнетворных микробов с отрицательными свойствами. Строго говоря, это разделение достаточно условно. Один и тот же вид бактерий может оказывать положительное или отрицательное действие в зависимости от ситуации. Например, кишечная палочка является частью микрофлоры здорового человека и принимает активное участие в пищеварении. Но стоит популяции этих бактерий разрастись выше граничных параметров – возникает опасность отравления токсинами, опасными для здоровья.

Как выглядят бактерии

Внешний вид и параметры клетки влияют на ее свойства – подвижность, функциональные особенности, крепление к поверхности. По форме микроорганизмы разделяются на:

1. Кокки – шаровидные или округлые бактерии. Они различаются по количеству клеток в сцепке:

• микрококки (единичная клетка);
• диплококки (две клетки, соединенные между собой);
• тетракокки (четыре соединенные клетки);
• стрептококки (соединенные в длину в виде цепи);
• сарцины (пласты или пакеты из 8, 12, 16 и более штук);
• стафилококки (соединение имеет форму виноградной грозди).

2. Палочки различают:

• по форме концов: плоские (обрубленные), округлые (полусфера), острые (конус), утолщенные;
• по характеру соединения: одиночные, пары, цепочки (стрептобактерии).

3. Спирали имеют изогнутую или спиральную форму (строго говоря, эти бактерии тоже относят к палочковидным). Они выделяются формой и количеством завитков:

• вибрионы – немного выгнутые;
• спириллы – один или несколько витков (до четырех);
• свыше четырех завитков имеют борелли (от 4 до 12) и (любимое ругательство доктора Быкова, возбудители сифилиса) трепонемы (от 14 до 17 мелких витков);
• лептоспиры похожи на латинскую «S».

Кроме этого, существуют звездочки, кубики, С-образные и другие формы клеток. Более того, один и тот же вид бактерий в зависимости от обстоятельств может менять форму, причем значительно. Например, молочнокислые бактерии представляют собой палочки, но одни представители вида могут иметь форму очень короткой палочки (почти шара), тогда как другие вытягиваются в длину, приближаясь к нитевидным клеткам. Длина в данном случае зависит от состава среды, наличия и процентного содержания кислорода, способа культивирования (искусственного выращивания) микроорганизмов.

С размерами одноклеточных немного проще:

• самые маленькие (бруцеллы);
• средние (бактероид, кишечная палочка);
• большие (бациллы, клостридии).

Строение микроорганизмов

Общим для всех прокариот является отсутствие ядра, его роль выполняет замкнутая молекула ДНК (нуклеоид). Роль внутренних органов в бактериальной клетке выполняют различные включения, именуемые по аналогии органеллами. У разных видов бактерий этот набор не одинаков, но есть некий обязательный минимум, присутствующий у каждой бактерии:

• нуклеоид (аналог ядра);
• клеточная стенка (наружный слой различной толщины);
• цитоплазматическая мембрана (тонкая пленка между внутренней полужидкой средой и клеточной стенкой);
• цитоплазма (внутренняя полужидкая субстанция, в которой плавают органеллы);
• рибосомы (молекулы РНК, содержащие дополнительную или резервную генетическую информацию).

Первые попытки рассмотреть строение бактерии в микроскоп выявили одну важную деталь – бактериальные клетки прозрачны, увидеть их без дополнительной подготовки невозможно. Датский исследователь Грам предложил метод, позволяющий окрашивать микроорганизмы с помощью анилиновых красителей. Оказалось, что в зависимости от строения наружной оболочки бактерии воспринимают краситель по-разному – одни задерживают пигмент, другие обесцвечиваются после окончательной промывки подготовленного препарата спиртосодержащим раствором (промывка производится в обоих случаях, но только в одном вымывает краску). По толщине клеточных стенок бактерии разделяют на две большие группы:

• грамположительные (толстая стенка поддается окраске);
• грамотрицательные (тонкая стенка не удерживает краситель).

Эти свойства важны для идентификации – чаще всего грамотрицательными бывают вредные (патогенные) микроорганизмы. Подобное разделение особенно удобно для медицинских исследований. Можно получить быстрый результат при относительно простом лабораторном анализе.

Помимо основных, у микроорганизмов существуют дополнительные структуры, определяющие некоторые важные свойства клетки:

1. Капсула – поверхностный (над клеточной оболочкой) слизистый слой, образующийся как реакция на окружающую среду. Т. е. в комфортных условиях бактерия вполне может обойтись без капсулы, но при малейшей угрозе защищает себя мягкой оболочкой, дающей дополнительную безопасность.
2. Жгутики – длинные (длиннее тела бактерии) нитевидные органы перемещения. Они работают как своеобразный двигатель, позволяя клетке свободно перемещаться.
3. Пили – очень мелкие ворсинки на поверхности бактерии (тоньше и короче жгутиков). Пили не перемещают клетку, но помогают ей надежно закрепиться в выбранном месте.
4. Споры – твердые включения, образующиеся внутри бактерий как реакция на угрозу гибели (отсутствие воды, агрессивная среда). Они позволяют клетке пережить тяжелые времена (иногда бактерия может «спать» годами и десятилетиями) и снова возродиться. Но споры – это только инструмент выживания, а не размножения.

Есть еще дополнительные включения, придающие бактерии различные свойства. Так, хлоросомы отвечают за выработку кислорода из энергии солнечного света (фотосинтез); газовые вакуоли придают клетке плавучесть; липиды и волютин сохраняют запасы пищи и энергии и т. д.

Рост и размножение

Для точной идентификации и промышленного производства необходимы чистые культуры бактерий – популяция, выращенная из единичной клетки в лабораторных условиях. А для этого нужно знать их биологические свойства – в каких условиях и каким образом растут и размножаются микроорганизмы. Рост – это увеличение клеточной массы и всех ее структур, а размножение – увеличение количества клеток в колонии.

Большинство бактерий размножаются методом бинарного деления, т. е. клетка делится надвое посередине, образуя два идентичных организма. Метод почкования отличается от бинарного деления только формой – на поверхности клетки образуется выступ, куда перемещается половинка разделившегося заменителя ядра (нуклеоида), затем выступ разрастается и отделяется от материнской клетки.

Более сложный метод – генетическая рекомбинация, напоминающая половое размножение. Суть метода в том, что часть ДНК попадает в клетку извне (при контакте бактерий между собой, с помощью бактериофагов или в результате поглощения генетического материала погибших клеток). В результате такой метод дает две генетически измененных клетки, несущих информацию от обоих «родителей». Свойства измененной клетки могут значительно отличаться от ее предшественниц. Такой метод размножения позволяет бактериям приспосабливаться к изменившимся условиям, возможно, именно он послужил основой возникновения разумной жизни на планете.

Кроме того, рекомбинантный метод размножения облегчает генетические исследования. Бактерии меняются в очень короткие сроки и при этом сохраняют наследственность. Это дает возможность проследить за несколькими поколениями клетки и оценить положительные и отрицательные изменения в ее структуре, поведении, свойствах.

Особенности дыхания и питания клетки

В зависимости от отношения к кислороду бактерии различаются на:

1. Анаэробы – микроорганизмы, получающие энергию при отсутствии кислорода. Различают облигатные (строгие) анаэробы, не переносящие кислорода, и факультативные анаэробы (большинство патогенных микробов), основным методом получения энергии которых является бескислородный вариант, но они могут существовать и при доступе кислорода.
2. Аэробы – клетки, живущие только в кислородосодержащей среде. Строгие аэробы требуют 20% кислорода в атмосфере, микроаэрофилы довольствуются гораздо меньшим содержанием кислорода, но основной метод дыхания у них остается таким же, как и у аэробных клеток.

Идентификация по способу дыхания и питания важна для создания комфортных условий при выращивании бактериальных культур на искусственных средах и в биотехнологиях.

Благодаря разнонаправленным полезным свойствам бактерий получается замкнутый цикл – автотрофы создают органические вещества, используя энергию солнца или неорганические соединения, гетеротрофы (сапрофиты) разлагают органику, возвращая в природу химические компоненты, пригодные для дальнейшего использования.

Ферменты и токсины бактерий (биохимическая активность)

Микроорганизмы вырабатывают белковые вещества – ферменты (лат. «закваска») или энзимы (греч. «закваска»), которые служат катализаторами (ускорителями) в абсолютно всех биологических процессах (обмен веществ и энергии). Причем каждый отдельно взятый фермент отвечает только за один процесс превращения одного соединения в другое. Ферменты делят на:

• эндоферменты – внутриклеточные вещества, принимают участие в метаболизме клетки.
• экзоферменты – внеклеточные (выделяемые в окружающую среду), они осуществляют переваривание снаружи бактериальной клетки.

Свойства микроорганизмов выделять определенные ферменты используют для идентификации вида одноклеточных, так как это постоянный и неизменный признак, присущий только данной разновидности клеток. Различают:

1. Сахаролитические свойства клетки – способность ферментировать (разлагать) углеводы с выделением химической энергии. Например, при спиртовом брожении ферменты дрожжей разлагают сахар на этиловый спирт и углекислый газ.
2. Протеолитические свойства микроорганизмов – ферментация белков и пептона (крупные белковые фрагменты, образующиеся на начальной стадии переваривания молока и мяса под действием ферментов). Клетки выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, аминокислоты) и/или до конечных продуктов распада (сероводород, аммиак). От протеолитических ферментов зависит усвоение белков, свертывание крови.

Биохимическая идентификация дает возможность различать практически идентичные виды бактерий, строение и внешний вид которых неотличимы друг от друга. Например, патогенные энтеробактерии насчитывают сотни видов, определить конкретного виновника заболевания можно только с помощью изучения биохимических свойств.

Вредные отходы жизнедеятельности клетки (токсины) крайне опасны, тем не менее важны. При попадании токсинов в организм происходит выработка антител, которые идентифицируют и нейтрализуют чужеродные объекты. Бактериальные токсины вызывают нарушения обменных и других процессов в клетке, этим объясняется их высокая активность даже при небольшом количестве токсина в организме. Различают:

• экзотоксины (выделяются в окружающую среду, очень опасны);
• эндотоксины (структурные компоненты клетки, попадают в окружающую среду только после гибели бактерии, менее опасны, чем экзотоксины).

Любые токсины опасны, но экзотоксины причиняют больший вред. Однако способность этих токсинов вызывать образование антител (антигенов) дает возможность производить лечебные и профилактические сыворотки против многих болезней.

Некоторые бактерии обладают гемолитическими свойствами, т. е. выделяют токсины, разрушающие эритроциты (гемолизины). В естественном процессе обновления эритроцитов гемолитические свойства клеток необходимы, но они могут стать опасными при патологическом развитии процесса.

Бактерии вездесущи и многообразны. Есть «добрые», полезные микроорганизмы, но есть и вредные, патогенные микробы, провоцирующие болезни и выделяющие опасные токсины. Человек научился использовать полезные свойства микроорганизмов в биотехнологиях для улучшения качества жизни. Медицина активно (и иногда эффективно) борется с возбудителями болезней. В силах любого человека защитить себя от вредных бактерий (обычные правила гигиены) и взять все лучшее от многообразия бактериального мира.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 12 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша- в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза - в 3-4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах - анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике.

В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

Для идентификации, т.е. определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипические признаки:

а) морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах;

б) биохимические признаки культуры по ее способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хромографию и другие методы.

Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции: агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др.

Методы выделения чистой культуры

Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий.

Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе

Метод последовательных разведений , предложен Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в проведении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенный в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях.

Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений ). Р. Кох использовал плотные питательные среды на основе желатина или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и немного охлажденным желатином, содержание которого позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После застудневания среды оно культивировалось при оптимальной температуре. В его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежую питательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий.

Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат открытой и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им занял материалу в другой чашке Петри, при потребности – в третьей. Только после этого шпатель окунают в дезинфицирующий раствор или прожаривают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний.

Колонии по методу Дригальского

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

Метод штрихов

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько преоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру

Методы выделения чистых культур, основанные на биологическом принципе

Биологический принцип разъединения бактерий предусматривает целеустремленный поиск методов, которые учитывают многочисленные особенности микробных клеток. Среди самых распространенных методов можно выделить следующие:

1. По типу дыхания. Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аэробные (Corynebacterium diphtheriae , Vibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetani , Clostridium botulinum , Clostridium perfringens и др.) . Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

2. По спорообразованию . Известно, что некоторые микробы (бациллы и клостридии) способны к споротворення. Среди них Clostridium tetani , Clostridium botulinum , Clostridium perfringens , Bacillus subtilis , Bacillus cereus . Споры стойкие к действию факторов внешней среды. Следовательно, исследуемый материал может быть подданный действию термического фактора, а затем инокулятивно перенесен в питательную среду. Спустя некоторое время на нем вырастут именно те бактерии, которые способны к споротворению.

3. Стойкость микробов к действию кислот и щелочей. Некоторые микробы (Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis ) в результате особенностей их химического строения стойки к действию кислот. Вот почему материал, который их содержит, например, мокрота при туберкулезе предварительно обрабатывают равным объемом 10 % раствора серной кислоты, а затем высевают на питательные среды. Посторонняя флора погибает, а микобактерии в результате их резистентности к кислотам, вырастают.

Холерный вибрион (Vibrio сholerae ) , напротив, является галофильной бактерией, потому для создания оптимальных условий роста его высевают на среды, которые содержат щелочь (1 % щелочная пептонная вода). Уже через 4-6 часов на поверхности среды появляются характерные признаки роста в виде нежной голубоватой пленки.

4. Подвижность бактерий. Некоторые микробы (Proteus vulgaris ) имеют тенденцию к ползучему росту и способны быстро распространяться по поверхности кое-что влажной среды. Для выделения таких возбудителей их засевают в капельку конденсационной жидкости, которая образуется при охлаждении столбика скошенного агара. Через 16-18 год они распространяются на всю поверхность среды. Если взять материал из верхней части агара, будем иметь чистую культуру возбудителей.

5. Чувствительность микробов к действию химических веществ, антибиотиков и других противомикробных средств. В результате особенностей метаболизма бактерий они могут иметь разную чувствительность к некоторым химическим факторам. Известно, что стафилококки, аэробные бациллы, которые образуют споры, стойкие к действию 7,5–10 % хлорида натрия. Вот почему для выделения этих возбудителей используют элективные питательные среды (желточно-солевой агар, манит-солевой агар), которые содержат именно это вещество. Другие бактерии при такой концентрации хлорида натрия практически не растут.

6. Введение некоторых антибиотиков (нистатин) используется для торможения роста грибов в материале, который сильно контаминированный ими. И, напротив, добавление антибиотика пеницилина к среде способствует росту бактериальной флоры, если нужно выделить грибы. Добавление фуразолидона в определенных концентрациях к питательной среде создает селективные условия для роста коринебактерий и микрококков.

7. Способность микроорганизмов проникать через неповрежденные кожные покровы. Некоторые патогенные бактерии (Yersinia pestis ) в результате наличия большого количества ферментов агрессии способны проникать через неповрежденную кожу. Для этого шерсть на теле лабораторного животного бреют и в этот участок втирают исследуемый материал, который содержит возбудителя и большое количество сторонней микрофлоры. Через некоторое время животное забивают, а из крови или внутренних органов выделяют микробов.

8. Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний. Отдельные животные проявляют высокую чувствительность к разным микроорганизмам.

Например, при любом способе введения Streptococcus pneumoniae белым мышам у них развивается генерализованная пневмококковая инфекция. Аналогичная картина наблюдается при заражении гвинейских свинок возбудителями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis ) .

В повседневной практике бактериологи пользуются такими понятиями как штамм и чистая культура микроорганизмов. Под штаммом понимают микробов одного вида, которые выделены из разных источников, или из одного и того же источника, но в разное время. Чистая культура бактерий – это микроорганизмы одного вида, потомки одной микробной клетки, которые выросли на (в) питательной среде.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают - внешний вид, консистенция, цвет, запах и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предварительный диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Затем проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя - методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. Если требуется, исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размером и тинкториальных (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже по внешнему виду и особенностям их роста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Определение вида бактерий по их морфологическим признакам называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей по их культуральным признакам называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виде выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Идентификация бактерий.

Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам называется биохимической идентификацией .

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию по антигенным свойствам. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи энтеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигелы) содержат оболочковый О-антиген, жгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологической идентификации .

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствам . Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.

ПРИЛОЖЕНИЯ

(таблицы и схемы)

Физиология бактерий

Схема 1. Физиология бактерий.

размножение

выращивание на питательных средах

Таблица 1. Общая таблица физиологии бактерий.

		Характеристика
		Процесс приобретения энергии и веществ.
		Совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток.
		Координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки
	Размножение	Увеличение числа клеток в популяции
	Выращивание на питательных средах.	В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на питательных средах, которые должны быть стерильными, прозрачными, влажными, содержать определенные питательные вещества (белки, углеводы, витамины, микроэлементы и др.), обладать определенной буферностью, иметь соответствующий рН, окислительно-восстановительный потенциал.

Таблица 1.1 Химический состав и физиологические функции элементов.

	Элемент состава		Характеристика и роль в физиологии клетки.
		Основной компонент бактериальной клетки, составляющий около 80 % ее массы. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18.20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе – потере клеткой воды в гипертоническом растворе – происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды микроорганизмы не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей.
		40 – 80 % сухой массы. Определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.
	Элемент состава	Характеристика и роль в физиологии клетки.
	Нуклеиновые кислоты	Выполняют функции, аналогичные нуклеиновым кислотам эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.
	Углеводы	Представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.
		Входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме биомолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии туберкулеза.
	Минеральные вещества	Обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.).Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.

Таблица 1.2. Азотистые основания.

Таблица 1.2.1 Ферменты

		Характеристика
	Определение	Специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках.
		Ферменты снижают энергию активации, обеспечивая протекание таких химических реакций, которые без них могли бы проходить только при высокой температуре, избыточном давлении и при других нефизиологических условиях, неприемлемых для живой клетки.
		Ферменты увеличивают скорость реакции примерно на 10 порядков, что сокращает полупериод какой-либо реакции с 300 лет до одной секунды.
		Ферменты «узнают» субстрат по пространственному расположению его молекулы и распределению зарядов в ней. За связывание с субстратом отвечает определённый участок молекулы ферментативного белка - его каталитический центр. При этом образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с образованием продукта реакции и свободного фермента.
	Разновидности	Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают различные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.	Эффекторные ферменты - ферменты катализирующие некоторые реакции (подробнее табл. 1.2.2.)
	Функциональная активность	Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм и прежде всего от температуры среды и ее pH. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37°С и pH 7,2-7,4.

КЛАССЫ ФЕРМЕНТОВ:

микроорганизмы синтезируют различные ферменты, принадлежащие ко всем шести известным классам.

Таблица 1.2.2. Классы эффекторных ферментов

	Класс фермента	Катализирует:
	Оксидоредуктазы	Перенос электронов
	Трансферазы	Перенос различных химических групп
	Гидролазы	Перенос функциональных групп на молекулу воды
		Присоединение групп по двойным связям и обратные реакции
	Изомеразы	Перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм
		Образование связей С-С, C-S, С-О, C-N за счёт реакций конденсации, сопряжённых с распадом аденозинтрифосфата (АТФ)

Таблица 1.2.3. Типы ферментов по образованию в бактериальной клетке

		Характеристика	Примечания
	Иидуцибельные (адаптивные) ферменты «индукция субстратом»	Ферменты, концентрация которых в клетке резко возрастает в ответ на появление в среде субстрата-индуктора. Синтезируются бактериальной клеткой только при наличии в среде субстрата данного фермента
	Репрессибельные ферменты	Синтез этих ферментов подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.	Примером репрессии ферментов может служить синтез триптофана, который образуется из антраниловой кислоты с участием антранилатсинтетазы.
	Конститутивные ферменты	Ферменты, синтезируемые вне зависимости от условий среды	Ферменты гликолиза
	Мультиферментные комплексы	Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально	Ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране.

Таблица 1.2.4. Специфические ферменты

	Ферменты	Идентификация бактерий
	Супероксид дисмутаза и каталаза	Все аэробы или факультативные анаэробы обладают супероксид дисмутазой и каталазой - ферментами, защищающими клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма. Практически все облигатные анаэробы не синтезируют эти ферменты. Только одна группа аэробных бактерий - молочнокислые бактерии каталазонегативны.
	Пероксидаза	Молочнокислые бактерии аккумулируют пероксидазу - фермент, катализирующий окисление органических соединений под действием Н202 (восстанавливается до воды).
	Аргининдигидролаза	Диагностический признак, позволяющий различить сапрофитические виды Pseudomonas от фитопатогенных.
		Среди пяти основных групп семейства Enterobacteriaceae только две - Escherichiae и Erwiniae- не синтезируют уреазу.

Таблица 1.2.5. Применение ферментов бактерий в промышленной микробиологии.

	Ферменты	Применение
	Амилаза, целлюлаза, протеаза, липаза	Для улучшения пищеварения применяют готовые препараты ферментов, облегчающих соответственно гидролиз крахмала, целлюлозы, белка и липидов
	Инвертаза дрожжей	При изготовлении сладостей для предупреждения кристаллизации сахарозы
	Пектиназа	Используют для осветления фруктовых соков
	Коллагеназа клостридий и стрептокиназа стрептококков	Гидролизуют белки, способствуют заживлению ран и ожогов
	Литические ферменты бактерий	Секретируются в окружающую среду, действуют на клеточные стенки патогенных микроорганизмов и служат эффективным средством в борьбе с последними, даже если они обладают множественной устойчивостью к антибиотикам
	Рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, полимеразы, ДНК-лигазы и прочие ферменты, направленно модифицирующие нуклеиновые кислоты	Используют в качестве инструментария в биоорганической химии, генной инженерии и генотерапии

Таблица 1.2.6. Классификация ферментов по локализации.

		Локализация
	Эндоферменты	В цитоплазме В цитоплазматической мембране В периплазматическом пространстве	Функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена.
	Экзоферменты	Выделяются в окружающую среду.	Выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.

Таблица 1.2.7. Ферменты патогенных микробов (ферменты агрессии)

	Ферменты
	Лецитовителлаза Лецитиназа	Разрушает клеточные мембраны	Посев исследуемого материала на питательную среду ЖСА Результат: зона помутнения вокруг колоний на ЖСА.
	Гемолизин	Разрушает эритроциты	Посев исследуемого материала на питательную среду кровяной агар. Результат: полная зона гемолиза вокруг колоний на кровяном агаре.
	Коагулаза-положительные культуры	Вызывает свертывание плазмы крови	Посев исследуемого материала на стерильную цитратную плазму крови. Результат: свёртывание плазмы
	Коагулаза-отрицательные культуры	Выработка маннита	Посев на питательную среду маннит в анаэробных условиях. Результат: Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора)
	Ферменты		Образование некоторых ферментов в лабораторных условиях
	Гиалуронидаза	Гидролизирует гиалуроновую ки­слоту - основной компонент соединительной ткани	Посев исследуемого материала на питательную среду, содержащую гиалуроновую кислоту. Результат: в пробирках, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.
	Нейраминидаза	Отщепляет от различных гликопротеидов, гликолипидов, полисахаридов сиаловую (нейраминовую) ки­слоту, повышая проницаемость различных тканей.	Выявление: реакция определения антител к нейраминидазе (РИНА) и другие (иммунодиффузные, иммуноэнзимные и радиоиммунные методы).

Таблица 1.2.8. Классификация ферментов по биохимическим свойствам.

	Ферменты		Обнаружение
	Сахаролитические	Расщепление сахаров	Дифференциально - диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.
	Протеолитические	Расщепление белков	Микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения микроорганизмы засевают в мясо-пептонный бульон.
	Ферменты, выявляемые по конечным продуктам	Образование щелочей Образование кислот Образование сероводорода Образование аммиака и др.	Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды

Схема 1.2.8. Ферментный состав.

ФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ ЛЮБОГО МИКРООРГАНИЗМА:

Определяется его геномом

Является стабильным признаком

Широко применяется для их идентификации

Определение сахаролитических, протеолитических и других свойств.

Таблица 1.3. Пигменты

	Пигменты	Синтез микроорганизмом
	Жирорастворимые каротиноидные пигменты красного, оранжевого или желтого цветов	Образуют сарцины, микобактерии туберкулеза, некоторые актиномицеты. Эти пигменты предохраняют их от действия УФ-лучей.
	Пигменты черного или коричневого цвета - меланины	Синтезируются облигатными анаэробами Bacteroides niger и др. не растворимы в воде и даже сильных кислотах
	Пирроловый пигмент ярко-красного цвета, – продигиозин	Образуется некоторыми серациями
	Водорастворимый фенозиновый пигмент, – пиоцианин.	Продуцируются синегнойными бактериями (Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с нейтральным или щелочным pH окрашивается в сине-зеленый цвет.

Таблица 1.4. Светящиеся и ароматообразующие микроорганизмы

		Условие и характеристика
	Свечение (люминесценция)	Бактерии вызывают свечение тех субстратов, например чешуи рыб, высших грибов, гниющих деревьев, пищевых продуктов, на поверхности которых размножаются. Большинство светящихся бактерий относятся к галофильным видам, способным размножаться при повышенных концентрациях солей. Они обитают в морях и океанах и редко - в пресных водоемах. Все светящиеся бактерии являются аэробами. Механизм свечения связан с освобождением энергии в процессе биологического окисления субстрата.
	Ароматообразование	Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, например уксусно-этиловый и уксусно-амиловый эфиры, которые придают аромат вину, пиву, молочнокислым и другим пищевым продуктам, вследствие чего применяются в их производстве.

Таблица 2.1.1.Метаболизм

		Определение
	Метаболизм	Биохимические процессы, протекающие в клетке, объединены одним словом - ме­таболизм (греч. metabole - превращение). Этот термин равнозначен понятию «обмен веществ и энергии». Различают две стороны метаболизма: анаболизм и катаболизм.
		Анаболизм - совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки, т. е. та сторона обмена веществ, которую называют конструктивным обменом.	Катаболизм - совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необ­ходимой, в частности, и для реакций конструктивного обмена. Поэтому катаболизм определяют еще как энергетический обмен клетки.
	Амфиболизм	Промежуточный обмен веществ, превращающий низкомолекулярные фрагменты питательных веществ в ряд органических кислот и фосфорных эфиров, называют

Схема 2.1.1. Метаболизм

МЕТАБОЛИЗМ –

совокупность двух противоположных, но взаимодействующих процессов: катаболизма и анаболизма

Анаболизм = ассимиляция = пластический метаболизм = конструктивный метаболизм

Катаболизм = диссимиляция = энергетический метаболизм = распад = обеспечение клетки энергией

Синтез (компонентов клетки)

Ферментативные катаболические реакции, в результате которых происходит выделение энергии , которая аккумулировалась в молекулах АТФ.

Биосинтез мономеров:

аминокислот нуклеотидов моносахаридов жирных кислот

Биосинтез полимеров:

белков нуклеиновых кислот полисахаридов липидов

В результате ферментативных анаболических реакция, энергия, выделенная в процессе катаболизма расходуется на синтез макромолекул органических соединений, из которых потом монтируются биополимеры – составные части микробной клетки.

Энергия расходуется на синтез компонентов клетки

Таблица 2.1.3. Обмен веществ и превращение энергии клетки.

	Обмен веществ	Характеристика	Примечания
		Обмен веществ обеспечивает присущее живому организму как системе динамическое равновесие, при котором взаимно уравновешиваются синтез и разрушение, размножение и гибель.	Обмен веществ - главный признак жизни
	Пластический обмен Синтез белков, жиров, углеводов.	Это совокупность реакций биологического синтеза.	Из веществ поступающих в клетку извне, образуются молекулы, подобные соединениям клетки, то есть происходит ассимиляция.
	Энергетический обмен	Процесс противоположный синтезу. Это совокупность реакций расщепления.	При расщеплении высокомолекулярных соединений выделяется энергия, необходимая для реакции биосинтеза, то есть происходит диссимиляция. При расщеплении глюкозы энергия выделяется поэтапно при участии ряда ферментов.

Таблица 2.1.2. Различие в метаболизме для идентификации.

Таблица 2.2 Анаболизм (конструктивный метаболизм)

Схема 2.2.2. Биосинтез аминокислот у прокариот.

Схема 2.2.1. Биосинтез углеводов у микроорганизмов.

Рисунок 2.2.3. Биосинтез липидов

Таблица 2.2.4. Этапы энергетического обмена – Катаболизм.

	Этапы	Характеристика	Примечание
	Подготовительный	Молекулы дисахаридов и полисахаридов, белков распадаются на мелкие молекулы – глюкозу, глицерин и жирные кислоты, аминокислоты. Крупные молекулы нуклеиновых кислот на нуклеотиды.	На этом этапе выделяется небольшое количество энергии, которая рассеивается в виде теплоты.
	Бескислородный или неполный или анаэробный или брожение или диссимиляция.	Образующиеся на этом этапе вещества при участии ферментов подвергаются дальнейшему расщеплению. Например: глюкоза распадается на две молекулы молочной кислоты и две молекулы АТФ.	В реакциях расщепления глюкозы участвует АТФ и H 3 PO 4 . В ходе бескислородного расщепления глюкозы в виде химической связи в молекуле АТФ сохраняется 40 % энергии, остальная рассеивается в виде теплоты. Во всех случаях распада одной молекулы глюкозы образовывается две молекулы АТФ.
	Стадия аэробного дыхания или кислородного расщепления.	При доступе кислорода к клетке образовавшиеся во время предыдущего этапа вещества окисляются (расщепляются) до конечных продуктов CO 2 и H 2 O .	Суммарное уравнение аэробного дыхания:

Схема 2.2.4. Брожение.

Бродильный метаболизм – характеризуется образованием АТФ посредством фосфорилирования субстратов.

Первая (окисление) = расщепление

Вторая (восстановление)

Включает превращения глюкозы в пировиноградную кислоту.

Включает утилизацию водорода для восстановления пировиноградной кислоты.

Пути образования пировиноградной кислоты из углеводов

Схема 2.2.5. Пировиноградная кислота.

Гликолитический путь (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса)

Путь Энтнера-Дудорова

Пентозо-фосфатный путь

Таблица 2.2.5. Брожение.

	Тип брожения	Представители	Конечный продукт	Примечания
	Молочнокислое		Образуют из пирувата молочную кислоту	В одних случаях (гомоферментное брожение) образуется только молочная кислота, в других также побочные продукты.
	Муравьинокислое	Enterobacteriaceae	Муравьиная кислота – один из конечных продуктов. (наряду с ней – побочные)	Некоторые виды энтеробактерий расщепляют муравьиную кислоту до H 2 иCO 2/
	Маслянокислое		Масляная кислота и побочные продукты	Некоторые вид ы клостридий наряду с масляной и другими кислотами образуют бутанол, ацетон и др. (тогда его называют ацетоно-бутиловое брожение).
	Пропионовокислое	Propionobacterium	Образуют из пирувата пропионовую кислоту	Многие бактерии при сбраживании углеводов наряду с другими продуктами образуют этиловый спирт. При этом он не является основным продуктом.

Таблица 2.3.1. Белоксинтезирующая система, ионный обмен.

	Название элемента	Характеристика
	Рибосомные субъединицы 30S и 50S	В случае бактериальных рибосом 70S субчастица 50S содержит рРНК 23S (длина ~3000 нуклеотидов) и субчастица 30S содержит рРНК 16S (длина ~1500 нуклеотидов); большая рибосомная субчастица кроме «длинной» рРНК содержит также одну или две «коротких» рРНК (5S рРНК бактериальных рибосомных субчастиц 50S или 5S и 5.8S рРНК больших рибосомных субчастиц эукариот). (подробнее – см. рис. 2.3.1.)
	Матричная РНК (мРНК)
	Полный комплект двадцати аминоацил-тРНК, для образования которых необходимы соответствующие аминокислоты, аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК и АТФ	Это заряженная энергией и связанная с тРНК аминокислота, готовая для подвоза к рибосоме и включения в синтезирующийся на ней полипептид.
	Транспортная РНК (тРНК)	Рибонуклеиновая кислота, функцией которой является транспортировка аминокислот к месту синтеза белка.
	Белковые факторы инициации	(у прокариот - IF-1, IF-2, IF-3) Получили свое название потому, что они участвуют в организации активного комплекса (708-комплекса) из субъединиц 30S и 50S, мРНК и инициаторной аминоацил-тРНК (у прокариот - формилметионил-тРНК), который «запускает» (инициирует) работу рибосом - трансляцию мРНК.
	Белковые факторы элонгации	(у прокариот - EF-Tu, EF-Ts, EF-G) Участвуют в удлинении (элонгации) синтезируемой полипептидной цепи (пептидила). Белковые факторы терминации или освобождения (англ. - release factors - RF) обеспечивают кодон-специфическое отделение полипептида от рибосомы и окончание синтеза белка.
	Название элемента	Характеристика
	Белковые факторы терминации	(у прокариот - RF-1, RF-2, RF-3)
	Некоторые другие белковые факторы (ассоциации, диссоциации субъединиц, высвобождения и пр.).	Белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы
	Гуанозинтрифосфат (ГТФ)	Для осуществления трансляции необходимо участие ГТФ. Потребность белок­синтезирующей системы в ГТФ очень специфична: он не может быть заменен ни одним из других трифосфатов. На биосинтез белка клетка затрачивает энергии больше, чем на синтез любого другого биополимера. Образование каждой новой пептидной связи требует расщепления четырех высокоэнергетических связей (АТФ и ГТФ): двух для того, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНК, и еще двух в ходе элонгации - одну при связывании аа-тРНК и другую при транслокации.
	Неорганические катионы в определенной концентрации.	Для поддержания рН системы в физиологических пределах. Ионы аммония используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот, ионы калия - для связывания тРНК с рибосомами. Ионы железа, магния выполняют роль кофактора в ряде ферментативных процессов

Рисунок 2.3.1. Схематическое изображение структур прокариотических и эукариотических рибосом.

Таблица 2.3.2. Особенности ионного обмена у бактерий.

	Особенность	Характеризуется:
	Высокое осмотическое давление	Благодаря значительной внутриклеточной концентрации ионов калия в бактериях поддерживается высокое осмотическое давление.
	Потребление железа	Для ряда патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, шигеллы и др.) потребление железа в организме хозяина затруднено из-за его нерастворимости при нейтральных и слабощелочных значениях pH	Сидерофоры – специальные вещества, которые, связывая железо, делают его растворимым и транспортабельным.
	Ассимиляция	Бактерии активно ассимилируют из среды анионы SO2/ и Р034+ для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.).
		Для роста и размножения бактерий необходимы минеральные соединения - ионы NH4+, К+, Mg2+ и др. (подробнее, смотри табл. 2.3.1.)

Таблица 2.3.3. Ионный обмен

	Название минеральных соединений	Функция
	NH 4 + (ионы аммония)	Используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот
	K + (ионы калия)	Используются для связывания т-РНК с рибосомами Поддерживают высокое осмотическое давление
	Fe 2+ (ионы железа)	Выполняют роль кофакторов в ряде ферментативных процессов Входят в состав цитохромов и других гемопротеидов
	Mg 2+ (ионы магния)
	SO 4 2 - (сульфат-анион)	Необходимы для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.)
	PO 4 3- (фосфат-анион)

Схема 2.4.1. Энергетический метаболизм.

Для синтеза бактерии нуждаются в…

Питательных веществах

Таблица 2.4.1. Энергетический метаболизм (биологическое окисление).

	Процесс	Необходимо:
	Синтез структурных компонентов микробной клетки и поддержание процессов жизнедеятельности	Достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.
	Энергия (АТФ)	Железобактерии получают энергию, выделяющуюся при непосредственном окислении ими железа (Fe2+ в Fe3+), которая используется для фиксации С02, бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений. Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования. Получение энергии происходит также в процессе дыхания (подробную таблицу смотри в соответствующем разделе).

Схема 2.4. Биологическое окисление у прокариот.

Распад полимеров на мономеры

Углеводы

глицерин и жирные кислоты

аминокислоты

моносахариды

Расщепление в бескислородных условиях

Образование промежуточных продуктов

Окисление в кислородных условиях до конечных продуктов

Таблица 2.4.2. Энергетический метаболизм.

	Понятие	Характеристика
	Сущность энергетического метаболизма	Обеспечение энергией клеток, необходимой для проявления жизни.
		Молекула АТФ синтезируется в результате переноса электрона от его первичного донора до конечного акцептора.
		Дыхание – биологическое окисление (расщепление). В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов различают дыхание : Аэробное – при аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород O 2 . Анаэробное – конечным акцептором электронов служат неорганические соединения: NO 3 - ,SO 3 - ,SO 4 2-
	Мобилизация энергии	Энергия мобилизуются в реакциях окисления и восстановления.
	Реакция Окисления	Способность вещества отдавать электроны (окисляться)
	Реакция Восстановления	Способность вещества присоединять электроны.
	Окислительно-восстановительный потенциал	Способность вещества отдавать (окисляться) или принимать (восстанавливаться) электроны. (количественно выражение)

Схема 2.5. Синтез.

углеводов

Таблица 2.5.1. Синтез

Таблица 2.5.1. Синтез

	Биосинтез	Из чего	Примечания
	Биосинтез углеводов	Автотрофы синтезируют глюкозу из CO 2 . Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений.	Цикл Кальвина (см. схему 2.2.1.)
	Биосинтез аминокислот	Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из: Пирувата α-кетоглутората фумората	Источник энергии – АТФ. Пируват образуется в гликолитическом цикле. Ауксотрофные микроорганизмы – потребляют готовые в организме хозяина.
	Биосинтез липидов	Липиды синтезируются из более простых соединений - продуктов метаболизма белков и углеводов	Важную роль играют ацетилпереносящие белки. Ауксотрофные микроорганизмы – потребляют готовые в организме хозяина или из питательных сред.

Таблица 2.5.2. Основные этапы биосинтеза белка.

	Этапы	Характеристика	Примечания
	Транскрипция	Процесс синтеза РНК на генах. Это процесс переписывания информации с ДНК – гена на мРНК – ген.	Осуществляется с помощью ДНК – зависимой РНК – полимеразы. Перенос информации о структуре белка к рибосомам происходит с помощью мРНК.
	Трансляция (передача)	Процесс собственного биосинтеза белка. Процесс расшифровки генетического кода в мРНК и осуществление его в виде полипептидной цепи.	Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания.

Примечание к таблице: Первичная структура каждого белка – последовательность расположения в нём аминокислот.

Схема 2.5.2. Цепи переноса электронов от первичного донора водорода (электронов) до конечного его акцептора O 2 .

Органическое вещество

(первичный донор электронов)

Флавопротеин (- 0,20)

Хинон (- 0, 07)

Цитохром (+0,01)

Цитохром C(+0,22)

Цитохром A(+0,34)

конечный акцептор

Таблица 3.1. Классификация организмов по типам питания.

	Элемент-органоген	Типы питания	Характеристика
	Углерод (С)	Аутотрофы	Сами синтезируют все углеродосодержащие компоненты клетки из CO 2 .
		Гетеротрофы	Не могут удовлетворять свои потребности за счёт CO 2 , используют готовые органические соединения.
		Сапрофиты	Источник питания – мёртвые органические субстраты.
			Источник питания – живые ткани животных и растений.
		Прототрофы	Удовлетворяют свои потребности с помощью атмосферного и минерального азота
		Ауксотрофы	Нуждаются в готовых органических азотистых соединениях.
	Водород (H)	Основным источником является H 2 O
	Кислород (O)

Таблица 3.1.2. Превращение энергии

Таблица 3.1.3. Способы углеродного питания

	Источник энергии	Донор электронов	Способ углеродного питания
	Энергия солнечного света	Неорганические соединения	Фотолитогетеротрофы
		Органические соединения	Фотоорганогетеротрофы
	Окислительно-восстановительные реакции	Неорганические соединения	Хемолитогетеротрофы
		Органические соединения	Хемоорганогетеротрофы

Таблица 3.2. Механизмы питания:

	Механизм	Условия	Градиент концентрации	Затраты энергии	Субстратная специфичность
	Пассивная диффузия	Концентрация питательных веществ в среде превышает концентрацию в клетке.	По градиенту концентрации
	Облегчённая диффузия	Участвуют белки пермеазы.	По градиенту концентрации
	Активный транспорт	Участвуют белки пермеазы.
	Транслокация химических групп	В процессе переноса происходит химическая модификация питательных веществ.	Против градиента концентрации

Таблица 3.3. Транспорт питательных веществ из бактериальной клетки.

	Название	Характеристика
	Фосфотрансферазная реакция	Происходит при фосфорилировании переносимой молекулы.
	Контрансляционная секреция	В этом случае синтезируемые молекулы должны иметь особую лидирующую последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через который молекулы белка смогут выйти в окружающую среду. Таким образом выходят из клетки соответствующих бактерий токсины столбняка, дифтерии и другие молекулы
	Почкование мембраны	Молекулы, образующиеся в клетке, окружаются мембранным пузырьком, который отшнуровывается в окружающую среду.

Таблица 4. Рост.

	Понятие	Определение понятия.
		Необратимое увеличение количества живого вещества, наиболее часто обусловленное делением клеток. Если у многоклеточных организмов обычно наблюдается увеличение размеров тела, то у многоклеточных увеличивается количество клеток. Но и у бактерий следует выделять увеличение количества клеток и увеличение клеточной массы.
	Факторы, влияющие на рост бактерий invitro.	Культуральные среды: Mycobacterium leprae не способны in vitro к Температура (растут в интервале): Мезофильные бактерии (20-40 о С) Термофильные бактерии (50-60 о С) Психрофильные (0-10 о С)
	Оценка роста бактерий	Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Факторы роста

Аминокислоты

Витамины

Азотистые основания

Таблица 4.1. Факторы роста

		Факторы роста	Характеристика	Функция
	Аминокислоты			Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем аминокислотам или другим соединениям, которые они не способны синтезировать.
	Пуриновые основания и их производные		Нуклеотиды:	Являются факторами роста бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм. Требуются для построения нуклеиновых кислот.
	Пиримидиновые основания и их производные		Нуклеотиды
	Факторы роста		Характеристика	Функция
			Нейтральные липиды	Входят в состав мембранных липидов
			Фосфолипиды
			Жирные кислоты	Являются компонентами фосфолипидов
			Гликолипиды	У микоплазм входят в состав цитоплазматической мембраны
	Витамины (в основном группы B)		Тиамин (B1)	Золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы
			Никотиновая кислота (B3)	Все виды палочковидных бактерий
			Фолиевая кислота (B9)	Бифидобактерии и пропионовокислые
			Пантотеновая кислота (B5)	Некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка
			Биотин (B7)	Дрожжи и азотфиксирующие бактерий Rhizobium
			Гемы – компоненты цитохромов	Гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза

Таблица 5. Дыхание.

	Название	Характеристика
		Биологическое окисление (ферментативные реакции)
	Основание	Дыхание основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ – универсального аккумулятора химической энергии.
	Процессы	При дыхании происходят процессы: Окисление – отдача донорами водорода или электронов. Восстановление – присоединение водорода или электронов к акцептору.
	Аэробное дыхание	Конечным акцептором водорода или электронов служит молекулярный кислород.
	Анаэробное дыхание	Акцептором водорода или электронов является неорганическое соединение – NO 3 - ,SO 4 2- ,SO 3 2- .
	Брожение	Акцептором водорода или электронов являются органические соединения.

Таблица 5.1. Классификация по типу дыхания.

	Бактерии	Характеристика	Примечания
	Строгие анаэробы	Энергетический обмен происходит без участия свободного кислорода. Синтез АТФ при потреблении глюкозы в анаэробных условиях (гликолиз) происходит за счет фосфорилирования субстрата. Кислород для анаэробов не служит конечным акцептором электронов. Более того, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие	у строгих анаэробов отсутствует фермент каталаза, поэтому накапливающаяся в присутствии кислорода оказывает на них бактерицидное действие; у строгих анаэробов отсутствует система регуляции окислительно-восста­новительного потенциала (редокс-потенциала).
	Строгие аэробы	Способны получать энергию только путём дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде. Организмы, получающие энергию и образующие АТФ при помощи только окислительного фосфорилирования субстрата, где окислителем может выступать только молекулярный кислород. Рост большинства аэробных бактерий прекращается при концентрации кислорода в 40-50 % и выше.	К строгим аэробам относят, например, представителей рода Pseudomonas
	Бактерии	Характеристика	Примечания
	Факультативные анаэробы	Растут как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода Аэробные организмы содержат чаще всего три цитохрома, факультативные анаэробы - один или два, облигатные анаэробы не содержат цитохромов.	К факультативным анаэробам относят энтеробактерии и многие дрожжи, способные переключаться с дыхания в присутствии 0 2 на брожение в отсутствии 0 2 .
	Микроаэрофилы	Микроорганизм, требующий, в отличие от строгих анаэробов, для своего роста присутствия кислорода в атмосфере или питательной среде, но в пониженных концентрациях по сравнению с содержанием кислорода в обычном воздухе или в нормальных тканях организма хозяина (в отличие от аэробов, для роста которых необходимо нормальное содержание кислорода в атмосфере или питательной среде). Многие микроаэрофилы так же являются капнофилами, то есть им требуется повышенная концентрация углекислого газа.	В лаборатории такие организмы легко культивируются в «свечной банке». «Свечная банка» это ёмкость, в которую перед запечатыванием воздухонепроницаемой крышкой вносят горящую свечу. Пламя свечи будет гореть до тех пор, пока не потухнет от недостатка кислорода, в результате чего в банке образуется атмосфера, насыщенная диоксидом углерода, с пониженным содержанием кислорода.

Таблица 6. Характеристика размножения.

Схема 6. Зависимость продолжительности генерации от различных факторов.

Продолжительность генерации

Вид бактерии

Популяция

Температура

Состав питательной среды

Таблица 6.1. Фазы размножения бактерий.

	Фаза	Характеристика
	Исходная стационарная фаза	Продолжается 1-2 часа. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.
	Лаг-фаза (фаза задержки размножения)	Характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.
	Лог-фаза (логарифмическая)	Отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии
	Фаза отрицательного ускорения	Характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.
	Стационарная фаза	Характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток.
	Фаза гибели	Происходит в постоянной скоростью и сменяется УП-УШ фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

Схема 7. Требования к питательным средам.

Требования

Вязкость

Влажность

Стерильность

Питательность

Прозрачность

Изотоничность

Таблица 7. Размножение бактерий на питательных средах.

	Питательная среда	Характеристика
	Плотные питательные среды	На плотных питательных средах бактерии образуют колонии – скопления клеток.
		S – тип (smooth – гладкий и блестящий) Круглые, с ровным краем, гладкие, выпуклые.	R – тип (rough – шершавый, неравный) Неправильной формы с изрезанными краями, шероховатые, вмятые.
	Жидкие питательные среды	Придонный рост (осадок) Поверхностный рост (плёнка) Диффузный рост (равномерное помутнение)

Таблица 7.1. Классификация питательных сред.

	Классификация	Виды	Примеры
	По составу		МПА – мясо-пептонный агар МПБ – мясо-пептонный бульон ПВ – пептонная вода
			Кровяной агар ЖСА – желточно-солевой агар Среды Гисса
	По назначению	Основные
		Элективные	Щелочной агар Щелочная пептонная вода
		Дифференциально - диагностические	Плоскирева
		Специальные	Вильсона-Блера Китта-Тароцци Тиогликолевый бульон Молоко по Тукаеву
	По консистенции		Кровяной агар Щелочной агар
		Полужидкие	Полужидкий агар
	По происхождению	Натуральные
		Полусинтетические
		Синтетические	Симмонсона

Таблица 7.2. Принципы выделения чистой культуры клеток.

Механический принцип	Биологический принцип
1. Фракционных разведений Л. Пастера 2. Пластинчастых разведений Р. Коха 3. Поверхностных посевов Дригальського 4. Поверхностных штрихов	Приймают во внимание: а - тип дыхания (метод Фортнера); б - подвижность (метод Шукевича); в - кислотоустойчивость; г - спорообразование; д - температурный оптимум; е - избирательную чувствительность лабораторных животных к бактериям

Таблица 7.2.1. Этапы выделения чистой культуры клеток.

	Этап	Характеристика
	1 этап исследования	Забирают патологический материал. Его изучают - внешний вид, консистенция, цвет, запахом и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом.
	2 этап исследования	На поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.
	3 этап исследования	Изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Таблица 7.3. Идентификация бактерий.

	Название	Характеристика
	Биохимическая идентификация	Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам
	Серологическая идентификация	С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию по антигенным свойствам
	Идентификация по биологическим свойствам	Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме
	Культуральная идентификация	Определения вида возбудителей по их культуральным признакам
	Морфологическая идентификация	Определение вида бактерий по их морфологическим признакам

Какой из процессов не относится к физиологии бактерий?

Размножение

Какие вещества составляют 40 – 80 % сухой массы бактериальной клетки?

Углеводы

Нуклеиновые кислоты

Какие классы ферментов синтезируют микроорганизмы?

Оксиредуктазы

Все классы

Трансферазы

Ферменты, концентрация которых в клетке резко возрастает в ответ на появление в среде субстрата-индуктора?

Иидуцибельные

Конституционные

Репрессибельные

Мультиферментные комплексы

Фермент патогенности, выделяемый золотистым стафилококком?

Нейраминидаза

Гиалуронидаза

Лецитиназа

Фибринолизин

Протеолитические ферменты выполняют функцию?

Расщепление белков

Расщепление жиров

Расщепление углеводов

Образование щелочей

Брожение энтеробактерий?

Молочнокислое

Муравьинокислое

Пропионовокислое

Маслянокислое

Какие минеральные соединения используются для связывания т-РНК с рибосомами?

Биологическое окисление это…?

1. Размножение

2. Гибель клеток

Какие вещества сами синтезируют все углеродосодержащие компоненты клетки из CO 2 .

Прототрофы

Гетеротрофы

Автотрофы

Сапрофиты

Питательные среды различаются:

По составу

По консистенции

По назначению

По всему из вышеперечисленного

Фаза размножения, которая характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток?

2. Фаза отрицательного ускорения

   Стационарная фаза

Продолжительность генерации зависит от?

Возраста

Популяции

Всего вышеперечисленного

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию, какую?

Биологическую

Морфологическую

Серологическую

Биохимическую

Метод поверхностных посевов Дригальского относят к…?

Механическим принципам выделения чистой культуры

Биологическим принципам выделения чистой культуры

Список литературы

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: учебник для мед. вузов. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2005.

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология: учебник для мед. вузов. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2005.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / учебник для мед. вузов. – Спб.: СпецЛит, 2000.

4.Воробьев А. А., Быков А. С., Пашков Е. П., Рыбакова А. М. Микробиология: учебник. – М.: Медицина, 2003.

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАр-Медиа, 2014.

6. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. В. В. Теца. – М.: Медицина, 2002.

Введение 6

Состав бактерий с точки зрения их физиологии. 7

Метаболизм 14

Питание (транспорт питательных веществ) 25

Дыхание 31

Размножение 34

Микробные сообщества 37

ПРИЛОЖЕНИЯ 49

Список литературы 105

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ (позднелат. identificare отождествлять) - определение видовой или типовой принадлежности микробов. И. м.- важнейший этап микробиол, исследования, необходимый для определения этиологии инфекционного заболевания; она имеет большое значение для эпидемиол, анализа вспышек инфекционных заболеваний и проведения эффективных мероприятий по их ликвидации. И. м. также широко используется при сан.-гиг. оценке почвы, воздуха, воды и пищевых продуктов.

И. м. осуществляется путем изучения комплекса морфол., культуральных, биохим., антигенных, патогенных и других свойств данной культуры, что позволяет установить ее идентичность (тождество) типичным представителям, определенного вида (типа) микроорганизмов. Для этих исследований, как правило, необходимо располагать чистой культурой, поскольку присутствие посторонних микробов может послужить поводом для ошибочных заключений.

Выбор методов исследования для И. м. в значительной мере определяется источником выделения микроба (напр., материалом, полученным от больного, из трупа или объектов окружающей среды).

Определение свойств микроорганизмов

Общих схем И. м., применяемых в практике, не существует. Для каждой группы микроорганизмов идентификация осуществляется на основе их биол, особенностей. Так, для идентификации вирусов (см.) важное значение имеют виды клеточных культур, в которых происходит их размножение, характер цитопатического действия, образование включений, антигенная структура, в некоторых случаях морфология вирусов, а также патогенность вирусов для экспериментальных животных.

Заслуживает внимания предложение некоторых исследователей [Кауэн и Стил (S. Т. Cowan, К. I. Steel), 1961, 1965; Сили и Ван-Демарк (H. W. Seeley, В. I. Van Demark), 1972] использовать в качестве исходного пункта идентификации бактерий окраску по Граму. На первой стадии дифференцирования грамположительных бактерий авторы учитывают форму клетки, кислотоустойчивость, спорообразование, подвижность, продукцию каталазы, оксидазы, отношение к глюкозе, а грамотрицательных бактерий - форму клетки, подвижность, продукцию каталазы, оксидазы и отношение к глюкозе. На последующих стадиях исследования, пользуясь таблицами, характеризующими бактерии, относящихся к определенному роду, находят ключ к определению видов, подвидов и типов.

Морфологические и тинкториальныe свойства

Изучение морфол, и тинкториальных признаков микроба является обычно лишь первоначальной стадией его идентификации. Морфология микроорганизмов изучается путем микроскопии фиксированных и окрашенных препаратов, а также живых неокрашенных микроорганизмов в висячей или раздавленной капле.

Для длительного наблюдения за живыми бактериями применяют специальные камеры (Пешкова, Фонбрюна). Микроскопическое исследование позволяет определить форму, размеры и строение микроорганизмов, их взаимное расположение, подвижность, количество и распределение жгутиков, форму и положение спор, а также образование капсул. Для изучения подвижности берут молодые (не старше 6-8 час.) быстрорастущие бульонные культуры. Жгутики легче обнаруживаются в молодых агаровых культурах, споры, наоборот, в культурах, выращенных в течение нескольких суток, а капсулы - в патол, экссудатах. При микроскопии висячей капли лучше пользоваться темным полем или фазово-контрастным устройством. При этом следует учитывать, что формы и размеры микроорганизмов изменяются в зависимости от особенностей штамма, возраста культуры, состава среды, температуры инкубации и других факторов.

Тинкториальные свойства микробов определяют при окраске фиксированных препаратов. Окраска по Граму позволяет разделить все бактерии на 2 группы: грамотрицательные и грамположительные (см. Грама метод). Окраска по Цилю- Нельсену дает возможность дифференцировать кислотоустойчивые бактерии от некислотоустойчивых (см. Циля-Нельсена метод). С помощью специальных методов выявляют отдельные элементы бактериальной клетки: нуклеоид, протоплазму и включения (методы Романовского- Гимзы, Фейльгена, Робино и др.), метахроматические гранулы (см. Нейссера методы и др.), жгутики, капсулы и споры. Метод флюоресцирующих антител делает возможным предварительное определение вида и даже типа микроба (см. Иммунофлюоресценция) .

В случаях специфичности морфологии микроба путем микроскопического исследования можно предположительно идентифицировать его. В мед. микробиологии такого рода идентификация обоснована только тогда, когда она соответствует клин, диагнозу. Так, напр., кислотоустойчивые палочки в цереброспинальной жидкости больного с клин, симптомами менингита можно предварительно отнести к туберкулезным микобактериям. Грамотрицательные биполярно окрашивающиеся овоидные палочки в соке лимф, узлов больного с паховыми бубонами в местности, где распространена чума, можно рассматривать предположительно как чумные бактерии.

Культуральные свойства указывают на принадлежность микроба к определенной группе и намечают направление дальнейших исследований в целях его окончательной идентификации. Их определяют путем посева изучаемой культуры на питательные среды (агар, бульон, уколом в желатину и др.). Из культуральных признаков бактерий и грибков важное значение имеют внешний вид и внутреннее строение колоний, формирующихся при высеве культуры на плотные питательные среды. Если микроб не дает роста на обычном мясопептонном агаре, то должна быть применена другая, оптимальная для него среда. Колонии обычно просматривают через 24 часа инкубации при t° 37°, а затем повторно с интервалом в 1 - 3 дня. При описании колоний обращают внимание на их размеры, цвет (пигментообразование), форму, профиль, поверхность, края, плотность. Если бактерии проявляют тенденцию к диссоциации на фазовые варианты (см. Диссоциация бактерий), то их разделяют путем рассева на чашках Петри с питательной средой. При росте на жидких питательных средах отмечают придонность роста, рост в виде пленки или равномерное помутнение среды. В некоторых случаях изучается рост на специальных средах, таких как сыворотка Леффлера, глицериновый картофель, среды, содержащие кровь, и др. Культуральные свойства микроба являются существенным дополнением к его морфол, признакам.

Резистентность микробов к различным факторам окружающей среды

Резистентность микробов к различным факторам окружающей среды используется при И. м., т. к. в ряде случаев микробы значительно отличаются по этому признаку. Так, напр., неспороносные бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий чувствительны к температуре и к малым концентрациям антисептиков. Они погибают при t° 60° в течение получаса и в 1% р-ре фенола в пределах 1 часа. Кислотоустойчивые бактерии чувствительны к температуре, но относительно резистентны к дезинфекционным средствам; они погибают при t° 60° в течение получаса, но на холоду противостоят антисептикам часто в течение нескольких часов. Особо высокой устойчивостью обладают споры бактерий (см. Споры, бактерий). Они погибают либо от пара под давлением (при t° 120° в течение получаса) или от высоких концентраций антисептиков, напр, под воздействием 5% фенола в течение нескольких часов. Поэтому при подозрении на образование микробом спор ставят пробы на резистентность к температуре.

Для определенных видов бактерий показательна их устойчивость к нек-рым антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Так, напр., одним из тестов, позволяющих дифференцировать классический холерный вибрион от вибриона Эль-Тор, а также Proteus mirabilis от других кишечных бактерий, служит способность вибриона Эль-Тор и Proteus mirabilis расти в присутствии полимиксина В (50 ед. в 1 мл и выше).

Особенности физиологии и биохимической активности

При определении биохимической активности микробов учитывают их отношение к кислороду, углекислоте и различным субстратам, оптимальную температуру роста, гемолитическую способность, а также влияние на их рост различных веществ, включая бактериальные факторы роста (см.). По отношению к свободному кислороду микробы обычно делят на строгие аэробы (см.), строгие и факультативные анаэробы (см.). Поэтому для выделения и идентификации возбудителя применяют специальные методы и питательные среды, способствующие росту только аэробных, факультативно-аэробных или анаэробных представителей.

Для большинства патогенных микробов оптимальная температура культивирования 37° (см. Бактерии).

Гемолитическая активность микробов определяется при выращивании их в чашках с кровяным агаром или же путем прибавления различных разведений бульонной культуры к взвеси отмытых эритроцитов.

Изучение влияния на рост бактерий различных биол, субстратов и хим. соединений (кровь, сыворотка, глюкоза, нитраты, соли желчных к-т, витамины, аминокислоты и др.) часто имеет значение для дифференциации этой группы микроорганизмов.

Для И. м. большое значение имеют особенности ферментативной активности микробов, выявляемые на средах, содержащих сахара и спирты, белковые субстраты и жиры (липолитические свойства), что позволяет выявить тончайшие различия между близкородственными микробами. Важно также определение редуцирующих свойств бактерий и их способности образовывать индол, аммиак и сероводород, использовать цитраты и тартраты (см. Дифференциально-диагностические среды).

Антигенная структура и отношение к бактериофагу

Антигенная структура и отношение к бактериофагу и бактерицинам изучаются на завершающем этапе И. м. Выявление антигенного строения микробов осуществляют при помощи различных серол, реакций, напр, реакции агглютинации (см.), реакции связывания комплемента (см.) и др.

Если в развернутой реакции агглютинации испытываемый микроб агглютинируется до титра иммунной сыворотки или половины титра, то на практике его можно считать принадлежащим к тому виду (типу), каким обозначена данная сыворотка. Для полной идентификации выделенный возбудитель должен агглютинироваться до титра иммунной сывороткой, приготовленной против эталонного микроба: испытуемый микроб должен адсорбировать из этой сыворотки все агглютинины. С другой стороны, эталонный микроб должен агглютинироваться до титра сывороткой, приготовленной против изучаемого микроба, и также адсорбировать из этой сыворотки все агглютинины. Иными словами, должна быть полная перекрестная агглютинация и перекрестная адсорбция между обеими сыворотками и обоими микробами. Реакция агглютинации иногда дополняется или заменяется реакцией преципитации (см.), а также реакцией непрямой гемагглютинации (с эритроцитами, нагруженными антителами). Серол, метод обнаруживает тончайшие различия между родственными микробами. Он часто является единственно доступным методом для дифференцирования подвидов или типов данного вида.

Широкое применение в лабораторной практике получили агглютинирующие монорецепторные сыворотки для идентификации сальмонелл, шигелл и других микробов. Весьма эффективно также применение метода иммунофлюоресценции (см.), который позволяет быстро (1 - 2 часа) осуществить И. м.

Чувствительным методом И. м. является типирование идентифицирующей культуры бактериофагом (см.). Этот метод используется, напр., при изучении брюшнотифозной палочки (см. Vi-брюшнотифозные фаги), т. к. позволяет распознавать фаготип в пределах вида. Специфические фаги применяют для дифференцирования шигелл, холерных вибрионов от холероподобных, классического холерного вибриона от вибриона Эль-Тор, чумной палочки от бактерий псевдотуберкулеза и других бактерий.

Для дифференцирования некоторых бактерий в пределах вида используют феномен бактериоциногении (см.), а также испытание чувствительности бактерий к бактерицинам различных типов (колицины, вибриоцины, пестицины, дифтериоцины и др.). Колицинотипирование нашло широкое применение для определения принадлежности выделенной культуры шигелл к определенному колицинотипу.

Патогенность для животных

Патогенность микробов обычно определяют в опытах на белых мышах, морских свинках и кроликах. Животных заражают подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, перорально, интраназально или интрацеребрально (см. Биологическая проба).

При изучении патогенных микроорганизмов иногда требуется определить, образуют ли они экзотоксины. С этой целью на чувствительных животных испытывается фильтрат бактериальной культуры, выращенной в течение определенного срока на соответствующей жидкой среде. Экзотоксины высокотоксигенных бактерий (дифтерийной палочки, столбнячной бациллы, ботулинической бациллы и др.) вызывают заболевание животных с характерной клин, картиной и последующую их гибель с типичными патол ого анатомическими изменениями. Для обнаружения некоторых микробных экзотоксинов применяют культуры чувствительных к ним тканей, а также куриные эмбрионы. Нейтрализация экзотоксинов специфическими антитоксинами играет существенную роль при И. м.

Библиография: Красильников Н. А. Определитель бактерий и актиномицетов, М.-Л., 1949, библиогр.; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, М., 1973; Тим а ков В. Д. и Гольдфарб Д. М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии, М., 1958, библиогр.; Bergey’s manual of determinative bacteriology, ed. by R. E. Buchanan a. N. E. Gibbons, Baltimore, 1975, bibliogr.; Cowan S. T. a. Steel K. J. Manual for the identification of medical bacteria, Cambridge, 1974; Identification methods for microbiology, ed. by В. M. Gibbs a. F. A. Skinner, v. 1-2, L.- N. Y., 1966-1968; International code of nomenclature of bacteria, ed. by S. P. Lapage a. o., Washington, 1975; M e у n e 1 1 G. G. a. M e y n e 1 1 E. Theory and practice in experimental bacteriology, Cambridge, 1970, bibliogr.; Nomura M. Colicins and related bacteriocins, Ann. Rev. Microbiol., v. 21, p. 257, 1967, bibliogr.; W i 1-s o n G. S. a. M i 1 e s A. A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology and immunity, v. 1-2, L., 1964.

А. В. Пономарев.